Поддержать программу
ПостНаука на Дожде
15:18
31 июля
Наука

Как изучают микроскопические объекты, и из чего состоит геном человека

Лекция биолога Евгения Шеваля
1 632
0
Расписание
Следующий выпуск
10 декабря 16:00
суббота: 16:00
воскресенье: 02:00, 10:00, 16:00
понедельник: 02:00, 06:00
вторник: 11:00

Биолог Евгений Шеваль о фиксации компонентов живой клетки, искусстве замораживания молекул и нуклеосомной фибрилле.

Больше лекций —  на сайте «ПостНауки»

Мы живем в постгеномное время. Каждый человек может пойти, отсеквенировать свой геном и получить полную информацию о тех генах, которые находятся в его клетках. В одной клетке человека содержится 46 хромосом, и общая длина молекул ДНК (каждая хромосома содержит одну молекулу ДНК) примерно два метра. На самом деле это очень длинные, тонкие молекулы. Два метра ДНК в каждой клетке упакованы в крошечное ядро. Размер ядра примерно 10 микрон. Считается, что компактизация молекулы ДНК в клетке — это примерно в 10 000 раз, то есть молекула совершенно фантастическим образом компактизирована. Парадокс заключается в том, что если прочитать геном не представляет особой сложности, то мы до сих пор не понимаем, как этот геном компактизируется в клетке. И эта проблема, которая исследуется уже точно больше столетия, очень далека от своего разрешения. Периодически случаются истории, когда приходится кардинально менять наши представления о том, как происходит процесс компактизации ДНК в составе клеточного ядра или в составе митотических хромосом.

Основной принцип компактизации молекулы ДНК, по-видимому, связан с последовательным формированием все более и более толстых фибрилл. Молекула компактизируется сначала в тонкую фибриллу, потом эта тонкая фибрилла компактизируется в более толстую, та в еще более толстую, и в какой-то момент получается митотическая хромосома. До недавнего времени казалось, что эти уровни более или менее описаны. Самый первый уровень компактизации молекулы ДНК связан с ее взаимодействием с так называемыми гистоновыми белками. Существуют две основные группы гистоновых белков. Коровые гистоны — это гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4, по две молекулы каждого из этих гистонов формируют такую белковую структуру, которая по форме напоминает хоккейную шайбу. И на эту хоккейную шайбу наматывается молекула ДНК. Молекула ДНК, тонкая-тонкая, двухнанометровая, делает 1,7 оборота вокруг этой шайбы, дальше идет линкерный участок, потом идет следующая шайба и так далее. Эту структуру можно увидеть в электронный микроскоп, она получила название «бусины на нити», и толщина такой фибриллы примерно 10 нанометров. Это считалось в течение очень долгого времени первым уровнем компактизации молекулы ДНК.

Что интересно, в самом начале изучения, когда появилась электронная микроскопия (а без нее изучать компактизацию ДНК невозможно), предполагалось, что это главная, основная и единственная фибрилла, из которой потом как-то формируется хромосома. Связано это было с методом изучения. В электронный микроскоп невозможно смотреть живую клетку. Электроны не могут пролететь через толстые объекты, потому объект должен быть очень тонким. Поэтому смотреть можно только мертвые образцы. Как образец сделать мертвым, это уже зависит от состояния техники эксперимента. Естественно, надо, чтобы все компоненты остались на своем месте и структуры максимально сохранили свои особенности, свойственные ей в живой клетке. Для этого используют самые разные жидкости, которые наливают на клетку, они клетку убивают и в идеале фиксируют состояние всех компонентов там, где это было в живой клетке, — это процедура фиксации.

Одним из первых хороших фиксаторов, которые использовались в электронной микроскопии, был тетраоксид осмия. Он хорошо фиксирует липиды и очень плохо связывает нуклеиновые кислоты, белки, поэтому в клетках видели именно 10-нанометровые фибриллы. Потом появились более удачные альдегидные фиксаторы, которые умеют взаимодействовать уже с белками. Они фактически сшивают все внутреннее пространство клетки в такую сеть, связывая белки, находящиеся рядом друг с другом. И такие фиксаторы уже более удачные. И когда были использованы альдегидные фиксаторы, оказалось, что никакой 10-нанометровой фибриллы в ядре обнаружить не удается в хромосомах, а обнаруживается более толстая фибрилла, которая получила название элементарной хроматиновой фибриллы. Ее толщина примерно 25–30 нанометров. И в течение нескольких десятилетий считалось, что именно эта фибрилла и есть основной структурный элемент компактизации ДНК.

Когда используются альдегиды или что-то еще для фиксации, то это химическая фиксация, с клеткой — все это понимают — могут происходить самые разные изменения, и количество неправильной информации достаточно велико. Бывает так, что во время фиксации какие-то белки меняют свою локализацию или вообще экстрагируются, уходят из клетки. Сейчас есть техника прижизненных наблюдений, и можно сравнить, что в живой клетке, а что после фиксации. Фиксация приводит к многочисленным артефактам. Поэтому всегда очень хочется найти способ более нативно изучить структуру хроматина, в том числе и в электронной микроскопии. Но как быть в электронной микроскопии?

Смотреть целую клетку прижизненно точно нельзя. Клетка должна быть нарезана очень-очень тонкими срезами — 30, 50, 70, 100 нанометров, но не толще, иначе электроны не пробьют. Тем не менее технология, которая позволила более или менее нативно посмотреть в электронный микроскоп на клетку, была разработана. И связана она уже с использованием не химических фиксаторов, а физической фиксации, а именно замораживания. В теории клетка — это такой водяной пузырек, в котором плавают разные молекулы, и если это заморозить, то, наверное, будет все хорошо. Проблема известна: при замораживании формируются кристаллы льда, которые все разрушают (биологические молекулы вообще очень нежные) до невозможности. Но можно не просто заморозить, а перевести воду в витрифицированное состояние. Если замораживать с очень большой скоростью, кристаллы льда не успевают сформироваться, вода в жидком состоянии фактически просто стабилизируется. Молекулы перестают диффундировать с огромной скоростью, вся структура стабилизируется, и это фактически твердая, но вода, там нет кристаллов. Задача была именно в том, чтобы перевести воду в такое состояние.

Самый простой способ перевести в такое состояние — взять очень-очень маленькие капельки и быстро их охладить. И если это сделать, будет то, что в этой капельке сохранит свою нативную структуру. Если посмотреть на образец в витрифицированном состоянии, можно надеяться, что мы увидим, как на самом деле выглядят те или иные органеллы, структуры, компактизированные молекулы ДНК — все что угодно. Сделать это достаточно сложно, технология развивалась очень долго. Самый простой способ, который применяется сейчас очень активно для изучения разных белковых молекул, комплексов, вирусов, рибосом, связан с тем, что образец, раствор, в котором находятся эти макромолекулярные комплексы, с невероятной скоростью опускается в жидкий тан. Температура низкая, и очень быстро происходит замораживание.

Но в случае с клетками, по крайней мере с животными клетками, такой метод работает уже гораздо хуже. Все-таки для такого подхода они большие. Но технологии развивались, и были предложены способы, которые позволили заморозить уже большие клетки, например клетки человека. Один из подходов заключается в следующем: образец одновременно очень быстро охлаждается и попадает в зону высокого давления. Высокое давление при замораживании (как известно, при замораживании вода немного расширяется, и плотность льда меньше, чем плотность воды) не дает увеличить объемы, и, как следствие, вода не кристаллизуется, а сохраняется в витрифицированном состоянии. На словах это очень просто, но на самом деле и прибор сложный, и работать на нем сложно, и получить на нем хорошие результаты — это целое искусство, до сих пор искусство.

Если вот так заморозить, образец переходит в витрифицированное состояние, то есть произошла физическая фиксация. Большие образцы так заморозить невозможно, но микроскопические кусочки ткани, даже ткани, не говоря уже про отдельные клетки, можно. Дальше этот лед можно, поскольку он в замороженном состоянии, тонко-тонко порезать. Естественно, это тоже специальные приборы, которые в замороженном состоянии производят резку. Дальше замороженные срезы можно перенести в электронный микроскоп (образец должен постоянно охлаждаться жидким азотом), и тогда на него можно посмотреть в электронном микроскопе фактически в нативном состоянии. О том, насколько нативно это состояние, идут, конечно, дискуссии. В теории, если бы мы таким образом заморозили клетку, а потом ее очень грамотно разморозили без образования кристаллов льда, то, наверное, она бы даже ожила и продолжала жить, синтезировать разные вещества и так далее. Но, к сожалению, это сделать не получается, тем не менее есть надежда, что это более нативное состояние. И когда на такие срезы посмотрели, причем изучали интерфазные ядра, где хроматин компактизирован по-разному: компактизированный хроматин сильно компактизирован, и есть диффузный хроматин, где идет активный синтез РНК, и в нем уровень компактизации ниже, — а также смотрели и на митотические хромосомы, где весь хроматин компактизирован, то удивительным оказалось то, что ни в тех ни в других образцах элементарную хроматиновую фибриллу не нашли. Ее просто не было. Нуклеосомы прекрасно видны, а 30-нанометровой элементарной хроматиновой фибриллы нет.

Ситуация получилась с точностью до наоборот по сравнению с тем, что было на ранних этапах изучения компактизации хромосом. Тогда сначала думали, что есть нуклеосомная 10-нанометровая фибрилла, ничего другого нет. Потом оказалось, что это не так, люди спорили, дискутировали, писали статьи. Пришли к выводу, что, скорее всего, как раз нуклеосомной фибриллы нет, а есть элементарные хроматиновые фибриллы. А здесь получается, что надо идти обратно, что элементарные хроматиновые фибриллы — это артефакт, их нет, а есть тонкая нуклеосомная фибрилла.

Это достаточно неприятно для тех людей, которые считали всю жизнь, что есть два уровня компактизации, а тут оказалось, что одного из них нет. Более того, оказалось, что сейчас можно за отдельными нуклеосомами следить прижизненно. Оказалось, что нуклеосомы внутри ядра нестабильны, они диффундируют, немного двигаются. Тогда возникла идея, почему мы не видим этой элементарной хроматиновой фибриллы. Элементарные хроматиновые фибриллы, если бы они были, находятся близко друг к другу. Нуклеосомы движутся, и они как бы способны проникать друг в друга. И отсутствие элементарной хроматиновой фибриллы, пусть косвенно, говорит о том, что взаимодействие гистоновых белков происходит не только в нуклеосомах, но и, скажем, между отдельными фибриллами. Это, в принципе, известный факт, это так и есть. И, более того, сейчас очень активно развивается направление, когда пытаются компьютерно симулировать компактизацию хроматина. Это довольно сложный процесс, требуется использовать суперкомпьютер. Тем не менее удается просчитать в компьютере, как должна компактизироваться молекула ДНК.

С одной стороны, да, некий отказ от старого, с другой — новые возможности. Это более динамичная структура, в которой фибриллы, отдельные молекулы фактически могут проникать друг в друга. Именно поэтому, из-за того, что они проникают друг в друга, а не лежат на расстоянии друг от друга, мы их не видим. Если бы это расстояние было, мы бы их видели. Они лежат рядом, отдельные нуклеосомы способны проникать из одной фибриллы в другую, и формируются не отдельные фибриллы, а общий такой расплавленный раствор нуклеосомных фибрилл. Откуда же берутся элементарные хроматиновые фибриллы, их же видели много десятилетий? Здесь все оказалось очень просто: если провести обычную альдегидную фиксацию, а потом изучить это в замороженном состоянии, то тогда 30-нанометровая элементарная хроматиновая фибрилла будет видна. Это артефакт фиксации. За счет того, что фибрилла зажимается при фиксации, она видна. А если бы она не сжалась, то мы бы видели единое поле расплавленных молекул, компактизированных с помощью гистонных белков ДНК.

Фото: DepositPhotos